GMPとは?

GMPとは?

ブロッティングとは?


(Southern blotting) は核酸プローブと相補的な塩基配列を持つ DNA 断片をメンブレン上で検出する手法。開発者の Edwin M. Southern の名をとってこう呼ばれる。一般には何らかの制限酵素で切断したDNAを電気泳動したのちに、ニトロセルロースなどの膜へ拡散もしくは吸引によってブロット(転写)する。転写した核酸はUVもしくは煮沸によりメンブレン上に固定する。その後ラベルしたプローブとハイブリダイズさせ目的のDNAの存在を検出する。プローブのラベルにはリンの放射性同位体の他、ディゴキシジェニン (DIG) が用いられる。


「ノーザンブロッティングとは」
ノーザンブロッティングとは、分子生物学研究において用いられるRNAを検出する手法である。サザンブロッティングがDNAを検出することに対して、同様の原理によることから名づけられた。

抽出した RNA を電気泳動によって展開し、メンブレンに転写したのち、標識した核酸プローブを用いて検出を行う。一般に転写産物の量やサイズを調べるために行う。

細胞からフェノール試薬などを用いて核酸を抽出した後、RNaseフリーのDNaseによってDNAのみを消化し、アガロース電気泳動などによってゲル上に展開する。このゲルを拡散もしくは吸引によってメンブレンに転写(ブロット)し、さらに検出したいRNA配列に相補的な核酸を標識した核酸プローブをハイブリさせることで標的RNAの量、サイズを検出する。標識にはRIを用いた方法があるが、最近はDIGと抗体を用いたnonRI法が一般的。


「ウェスタンブロッティングとは」
ウェスタンブロッティング (Western blotting; WB) は電気泳動によって分離した蛋白質を膜に転写し、任意の蛋白質に対する抗体でその蛋白質の存在を検出する手法。サザンブロッティング(南)、ノーザンブロッティング(北)の流れから、半ばジョークで命名されている。前二者は核酸どうしの相補性を利用したが本法は抗体の特異性によって目的の分子を区別している。よってイムノブロット (immunoblot; IB) とも呼ばれる。
通常はタンパク質の立体構造を破壊するために、SDSや2-メルカプトエタノールを加えたバッファーにタンパク質を溶解する。SDS を含んだポリアクリルアミドゲルに展開し、ニトロセルロースやPVDF膜に転写する。この膜に対して免疫染色を行うことで、タンパク質を検出する。

日本の場合狂牛病の二次検査で異常型プリオンの検出に用いられている手法の一つ。

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