Técnicas de edición genómica y desarrollo de ensayos enzimáticos como herramientas en el estudio de dianas terapéuticas para el tratamiento de enfermedades causadas por Leishmania infantum

Resumen

La leishmaniasis es una enfermedad parasitaria causada por protozoos del género Leishmania y transmitida por la picadura de hembras de flebótomo que afecta principalmente a áreas con bajos recursos económicos. La eficacia de los tratamientos actuales ha disminuido por su alta toxicidad y por la aparición de resistencias, de modo que el desarrollo de nuevos tratamientos es crítico. El sistema CRISPR/Cas9 ha supuesto una revolución en los últimos años como sistema de edición genómica para el estudio de dianas terapéuticas por su sencillez y efectividad. Este sistema permite delecionar las copias endógenas de un gen para estudiar los efectos de la falta de expresión de la proteína que codifica en la biología del parásito y así determinar si se trata de una diana relevante para el desarrollo de fármacos. En Leishmania, este sistema fue implementado por primera vez en el año 2015 en la especie Leishmania major. En la presente memoria se describe la implementación de dos sistemas CRISPR/Cas9 diferentes en Leishmania infantum, especie de interés en nuestro grupo de investigación al ser causante de la forma más letal de la enfermedad. Este sistema se usó para estudiar dos proteínas diferentes: i) proteína miristoilada pequeña 4 (SMP-4, por sus siglas en inglés), una proteína que hipotéticamente está implicada en procesos de muerte celular programada de la cual se desconoce su función; y ii) purina desoxirribosiltransferasa (PDT), una proteína que participa en el metabolismo de reciclaje de purinas. Una vez generados parásitos con ausencia de expresión de estas proteínas, se estudió su viabilidad tanto en el estadio promastigote como amastigote, su capacidad infectiva en macrófagos y la respuesta a diferentes estímulos relacionados con muerte celular en el caso de SMP-4 y fármacos que inhiben otras proteínas importantes del metabolismo de ácidos nucleicos en el caso de PDT. Las técnicas de edición genómica descritas no son válidas en el estudio de genes esenciales, ya que la deleción completa de los genes que las codifican no es compatible con la viabilidad de los parásitos. En la presente memoria se describe la generación de un nuevo sistema de expresión condicional o inducible, con el objetivo de controlar la expresión del gen diana de manera exógena reduciendo la expresión de la proteína a lo mínimo compatible con la viabilidad del parásito con el objetivo de llevar a cabo los estudios ya mencionados. Una vez identificada una diana de interés, el siguiente paso en el descubrimiento de nuevos tratamientos es el desarrollo de ensayos con los que testar la eficacia inhibitoria de moléculas candidatas. En este sentido, una enzima con gran interés terapéutico es la tripanotión sintetasa (TryS) por su papel en la síntesis de tripanotión. El tripanotión es la molécula central del sistema de defensa antioxidante que permite sobrevivir al parásito dentro de los macrófagos. En este trabajo, se expresó y purificó esta proteína con el propósito de implementar un nuevo ensayo enzimático para buscar compuestos químicos que inhiban su actividad.