７月２６日に「基本国策要綱」を閣議決定し、「皇道の大精神に則りまづ日満支をその一環とする大東亜共栄圏の確立をはかる」（松岡外相の談話）構想を発表。新体制運動を展開し、全政党を自主的に解散させ、８月１５日の民政党の解散をもって、日本に政党が存在しなくなり、「大正デモクラシー」などを経て日本に根付くと思われていた議会制政治は死を迎えた。

しかし、一党独裁は日本の国体に相容れないとする「幕府批判論」もあって、会は政治運動の中核体という曖昧な地位に留まり、独裁政党の結成には至らず、１０月１２日に大政翼賛会の発足式で「綱領も宣言も不要」と新体制運動を投げ出した。

また、新体制運動の核の一つであった経済新体制確立要綱が財界から反発を受け、近衛が当初商工大臣に据えようとした革新官僚の商工次官・岸信介は辞退したために代わりに任じた小林一三は経済新体制要綱の推進者である岸と対立、小林は岸を「アカ」と批判した。

内務大臣となった平沼騏一郎は経済新体制確立要綱を骨抜きにさせて決着を図り、平沼らはさらに経済新体制確立要綱の原案作成者たちを共産主義者として逮捕させ、岸信介も辞職した。この間、新体制推進派は閣僚を辞職し、平沼は大政翼賛会を公事結社と規定し、大政翼賛会の新体制推進派を辞職させた。

９月２３日に北部仏印進駐。９月２７日に日独伊三国軍事同盟を締結。第二次世界大戦における枢軸国の原型となった。

１１月１０日には神武天皇の即位から２６００年目に当たるとして紀元二千六百年記念式典を執り行って国威を発揚した。

１９４１年（昭和１６年）１月１１日、任期満了に伴う４月の衆議院選挙を１年延期し、対米戦決意を明らかにし、国防国家建設に全力を挙げる態勢をとることで、近衛首相と風見章と有馬頼寧の意見が一致した。

さらに近衛首相らは、１月２０日、声明を発して対米戦気運を醸成するとともに大政翼賛会にて対米戦に備える国民運動を組織化することを決定したが、声明自体は取り止めになった。

１９４１年（昭和１６年）４月１３日に日ソ中立条約を締結。近衞らは日米諒解案による交渉を目指すも、この内容が三国同盟を骨抜きにする点に松岡洋右は反発し、松岡による修正案がアメリカに送られたが、アメリカは修正案を黙殺した。

６月２２日に独ソ戦が勃発、ドイツ、イタリアと三国同盟を結んでいた日本は、独ソ戦争にどう対応するか、御前会議にかける新たな国策が直ちに求められた。

陸軍は独ソ戦争を、仮想敵国ソビエトに対し軍事行動をとる千載一遇のチャンスととらえた。

一方海軍も、この機に資源が豊富な南方へ進出しようと考えた。大本営政府連絡会議では松岡洋右は三国同盟に基づいてソ連への挟撃を訴えた。

７月２日の御前会議で「情勢ノ推移ニ伴フ帝国国策要綱」が決定された。この国策の骨格は海軍が主張した南方進出と、松岡と陸軍が主張した対ソ戦の準備という二正面での作戦展開にあった。

この決定を受けてソビエトに対しては７月７日いわゆる関東軍特種演習を発動し、演習名目で兵力を動員し、独ソ戦争の推移次第ではソビエトに攻め込むという作戦であった。一方南方に対して南部仏印への進駐を決定した。

７月１８日に内閣総辞職した。足枷でしかなかった松岡洋右を更迭するためであった（大日本帝国憲法では内閣総理大臣が閣僚を罷免できる権限が無かったため）。

第三次内閣

１９４１年（昭和１６年）７月１８日に、 第3 次近衛内閣 を組織。外相には、南進論者の海軍大将・豊田貞次郎を任命した。

７月２３日にすでにドイツに降伏していたフランスのヴィシー政権からインドシナの権益を移管され、それを受けて７月２７日に南部仏印進駐を実行し、７月３０日にサイゴンへ入城。

しかしこれに対するアメリカの対日石油全面輸出禁止等の制裁強化により日本は窮地に立たされることとなった。

９月６日の御前会議では、「帝国国策遂行要領」を決定。イギリス、アメリカに対する最低限の要求内容を定め、交渉期限を１０月上旬に区切り、この時までに要求が受け入れられない場合、アジアに植民地を持つイギリス、アメリカ、オランダに対する開戦方針が定められた。

御前会議の終わった９月６日の夜、近衞はようやく日米首脳会談による解決を決意し駐日アメリカ大使ジョセフ・グルーと極秘のうちに会談し、危機打開のため日米首脳会談の早期実現を強く訴えた。事態を重く見たグルーは、その夜、直ちに首脳会談の早期実現を要請する電報を本国に打ち、国務省では日米首脳会談の検討が直ちに始まった。

しかし、国務省では妥協ではなく力によって日本を封じ込めるべきだと考え、１０月２日、アメリカ国務省は日米首脳会談を事実上拒否する回答を日本側に示した。

陸軍はアメリカの回答をもって日米交渉も事実上終わりと判断し、参謀本部は政府に対し、外交期限を１０月１５日とするよう要求した。外交期限の迫った１０月１２日、戦争の決断を迫られた近衞は外相・豊田貞次郎、海相・及川古志郎、陸相・東條英機、企画院総裁・鈴木貞一を荻外荘に呼び、対米戦争への対応を協議した。

いわゆる「荻外荘会談」である。そこで近衞は「今、どちらかでやれと言われれば外交でやると言わざるを得ない。

（すなわち）戦争に私は自信はない。

自信ある人にやってもらわねばならん」と述べ、１０月１６日に政権を投げ出し、１０月１８日に内閣総辞職した。近衞と東條は、東久邇宮稔彦王を次期首相に推すことで一致した、しかし、東久邇宮内閣案は皇族に累が及ぶことを懸念する内大臣・木戸幸一らの運動で実現せず、東條が次期首相となった。

近衞は東條を首相に推薦した重臣会議を病気を理由に欠席しているが、当時９１歳の清浦奎吾が出席していたのと対比されて後世の近衞批判の一因となった。

ただ、近衞の娘婿で秘書官を務めていた細川護貞は「当時の近衞は痔に悩んでおり、昭和１６年の１０月頃は椅子にも深く座れず腰を少しだけ載せていたほど症状がひどかった」と保阪正康のインタビューに語っており、近衞の健康状態悪化が政権投げ出しや重臣会議欠席につながったのは事実の可能性がある（保阪著『続昭和の怪物七つの謎』講談社、２０１９年）。